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原代细胞具有贴壁特殊性，因此在消化后转移至其他实验器皿（如玻璃爬片、培养板、共聚焦培养皿等）时，常出现贴壁不牢的情况，因此我们需要对实验器皿进行包被处理，以增强细胞的贴壁性。
本期细胞学堂将为您详述原代细胞培养中的包被操作步骤及注意事项，让您的实验顺畅无阻！
为了适应不同实验需求，需要对培养器皿用不同的物质包被后使用，包被条件常选用胶原蛋白Ⅰ（12μg/mL）、多聚赖氨酸PLL（0.1mg/mL）和明胶（0.1%）三种，依据细胞种类而定。
NO、1
胶原蛋白Ⅰ
胶原蛋白Ⅰ是最常见的胶原蛋白，能促进细胞的贴壁和增殖，常用于上皮细胞、肝细胞、肌细胞等原代细胞的培养；
NO.2
多聚赖氨酸PLL
多聚赖氨酸是一种合成化合物，是带正电荷的氨基酸，通过改变培育基质外表的电极来促进细胞贴壁，其包被的培养板适用于神经元细胞、神经胶质细胞及转染细胞系的培养；
NO.3
明胶
明胶来自于胶原的高分子量水溶蛋白混合物，0.1％的明胶溶液常用于包被培养器皿以促进细胞贴壁。明胶包被板常用于培养正常或转染细胞如血管内皮细胞、心肌细胞、胚胎干细胞、胰岛细胞等。
1
准备器皿
取出无菌培养器皿，如T25培养瓶（以下以T25瓶为例）；
2
加包被试剂
取出包被试剂，在超净工作台内用移液器吸取1-2mL，加入T25瓶内，轻轻晃动瓶身，确保底部全部覆盖液体（注：使用的包被试剂为胶原蛋白Ⅰ或明胶时，1瓶可一次性加入5mL，同时包被5瓶，用5mL润洗每瓶瓶底部后，每瓶均分1mL进行后续包被操作)；
3
放入培养箱
将培养瓶盖好，放入37℃培养箱。PLL包被需要静置30-60min以上，胶原蛋白Ⅰ包被和明胶包被需要静置1-2h以上；
4
吸取包被试剂
取出培养瓶，吸出多余包被试剂（可留取下次使用，建议PLL试剂重复使用不超过2-3次，胶原蛋白Ⅰ和明胶重复使用不超过1次，多次使用会增加污染概率，减弱包被效果）；
5
静置
将培养瓶盖好，放入37℃培养箱（也可放4℃冰箱，保持无菌即可），静置4-24h以上，确保培养瓶底部干燥、无液体。包被完毕，培养瓶一般可存放3-7天（常温或4℃），建议3天内使用，存放过久，包被效果可能失效；
6
清洗
取出包被好的培养瓶，在超净工作台内，用PBS或培养基清洗。PLL包被的培养瓶需清洗2-3次，胶原蛋白Ⅰ和明胶包被培养瓶则清洗1-2次即可；
7
包被完成
正常接种使用培养瓶。
01
包被试剂的保存：无菌多聚赖氨酸PLL（0.1mg/mL）需要4℃下保存，可保存三个月；无菌胶原蛋白Ⅰ（12μg/mL）和无菌明胶（0.1%）需要在4℃下保存，1-2周内使用，蛋白制品放置过久易失效；
02
选择包被液用量依据不同培养器皿而定，一般确保培养器皿底部完-全覆盖为准（并且确保包被时间内不干）；
培养器皿 | 用量推荐（仅供参考） |
12孔板/孔 | 0.5mL |
6孔板/孔 | 0.8mL |
6cm培养皿/皿 | 1-1.5mL |
10cm培养皿/皿 | 3mL |
T25瓶/瓶 | 1-1.5mL |
T75瓶/瓶 | 3-4mL |
03
PLL有轻微毒性，胶原蛋白Ⅰ、明胶配置溶剂部分有少量毒性，所以包被后的培养器皿，使用前必须用PBS或培养基清洗1-3次；
04
细胞爬片等玻璃制品因材质问题，本身吸附能力弱，一般必须包被；
05
包被分为包被时间和干燥时间，包被时间是包被液吸附作用时间，一般按推荐时间即可。干燥时间是包被后培养器皿晾干时间，是为了确保包被液晾干，达到更好的粘性吸附效果；
06
以上所有操作均以无菌试剂、耗材，无菌环境内操作为前提。
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