鸡卵泡颗粒细胞分离、培养实验步骤

　　鸡卵泡颗粒细胞分离、培养实验步骤：
 

　　A. 翅下静脉注射2mL EDTA-2Na(W/V，2%)溶液处死母鸡，新洁尔灭消毒液浸泡消毒5min，打开腹腔，剪取整个卵巢，小心剥离卵泡(以8-15g为最佳)，置于装有PBS缓冲液的无菌培养皿中；
 

　　B. 用加有双抗的PBS缓冲液冲去血污，漂洗3次；将漂洗干净的卵泡移入装有预冷PBS缓冲液的平皿中，剥净卵泡外膜、结缔组织及血管网；
 

　　C. 用手术刀在卵泡表面划一道1-2cm长的切口(动作要快)，释放卵黄，用PBS缓冲液将剩余的卵黄液漂洗干净，剩下的卵泡膜即为：基膜和卵泡颗粒细胞层；
 

　　D. 将漂洗干净的卵泡膜尽量剪碎，置于15mL离心管中，加4mL培养基，用1mL移液枪反复吹打1min，自然沉降5min，收集上清液备用；
 

　　E. 向离心管内加入4mL 0.2%Ⅱ型胶原酶，重悬沉淀，置于37℃恒温水浴锅中消化30min，每5min震荡一次；
 

　　F. 消化结束，加入4mL M199*培养基(含10%血清)终止消化；用200目不锈钢筛过滤，收集滤液，1200rpm离心5min；
 

　　G. 沉淀用M199洗2次，室温离心，1200rpm，5min；弃上清，加入M199*培养基(含5%FBS及1%双抗)重悬后接种于6孔塑料培养皿，置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养；12-24h后换液，随后每天观察，2-3天换液一次，待鸡卵泡颗粒细胞生长融合用于实验。